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Nature volume 615, pages 925-933 (2023)Citer cet article

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Le doublement du génome entier (WGD) est un événement récurrent dans les cancers humains et favorise l'instabilité chromosomique et l'acquisition d'aneuploïdies1,2,3,4,5,6,7,8. Cependant, l'organisation tridimensionnelle de la chromatine dans les cellules WGD et sa contribution aux phénotypes oncogènes sont actuellement inconnues. Nous montrons ici que dans les cellules déficientes en p53, WGD induit une perte de ségrégation de la chromatine (LCS). Cet événement est caractérisé par une ségrégation réduite entre les chromosomes courts et longs, les sous-compartiments A et B et les domaines chromatiniens adjacents. Le LCS est piloté par la régulation négative de CTCF et de H3K9me3 dans les cellules qui ont contourné l'activation du point de contrôle tétraploïde. Des analyses longitudinales ont révélé que le LCS prépare les régions génomiques au repositionnement des sous-compartiments dans les cellules WGD. Cela entraîne des changements chromatiniens et épigénétiques associés à l’activation des oncogènes dans les tumeurs résultant des cellules WGD. Notamment, les événements de repositionnement des sous-compartiments étaient largement indépendants des altérations chromosomiques, ce qui indique qu'il s'agissait de mécanismes complémentaires contribuant au développement et à la progression de la tumeur. Dans l’ensemble, le LCS initie des changements de conformation de la chromatine qui aboutissent finalement à des modifications épigénétiques et transcriptionnelles oncogènes, ce qui suggère que l’évolution de la chromatine est une caractéristique du cancer induit par le WGD.

WGD est défini par la duplication de l’ensemble des chromosomes au sein d’une cellule. Elle a été observée dans des lésions précoces et pré-cancéreuses de divers tissus2,9,10, et on estime qu'elle survient dans environ 30 % des cancers humains3. Le WGD favorise l'acquisition d'altérations chromosomiques5,6,7,8 dans des milieux génétiques permissifs, comme dans les cellules déficientes en p53 ou en Rb3,4, qui peuvent favoriser la tumorigenèse1,5. Cependant, la tétraploïdisation de noyaux uniques est également susceptible d'induire des altérations de la structure tridimensionnelle (3D) et des caractéristiques épigénétiques de la chromatine. Pendant l'interphase, la chromatine est organisée selon une architecture 3D multicouche de compartiments, de domaines de chromatine et de boucles11,12,13,14,15,16, et est étroitement associée à l'activité de la chromatine et aux états cellulaires17. Des altérations de la structure de la chromatine ont été rapportées dans de nombreux types de tumeurs et sont dues à une altération de la liaison du CTCF ou de la cohésine18,19, à des variantes structurelles des chromosomes20,21,22 ou à des modifications aberrantes des histones22,23,24,25. Nous étudions ici comment la chromatine est organisée dans les cellules soumises au WGD. De plus, nous étudions quelles caractéristiques de la structure de la chromatine sont affectées par le WGD et si des changements dans l'organisation de la chromatine émergent et affectent les phénotypes cellulaires après le WGD. Enfin, nous examinons si ces changements sont en corrélation avec des altérations génétiques et épigénétiques des tumeurs induites par le WGD.

Pour comprendre l'impact du WGD sur l'organisation de la chromatine et le développement de la tumeur, nous avons utilisé trois modèles cellulaires distincts : (1) la lignée cellulaire diploïde non transformée hTERT-RPE1 (ci-après dénommée RPE) ; (2) Cellules CP-A dérivées d'un patient atteint de l'œsophage de Barrett, une maladie précancéreuse qui prédispose au développement d'un adénocarcinome œsophagien via WGD9,26 ; et (3) la lignée cellulaire leucémique proche triploïde K562. Pour imiter le fond génétique permissif observé dans les tumeurs humaines , nous avons utilisé des cellules CP-A déficientes en p53 (Extended Data Fig. 1a) et des cellules RPE (anciennement appelées cellules RPETP53−/−) . Les cellules K562 hébergent déjà une mutation de perte de fonction dans le gène TP5328. Les cellules WGD ont été obtenues par glissement mitotique dans deux clones indépendants CP-A TP53−/− (clone 3 et clone 19) et K562, et par échec de la cytokinèse en utilisant deux protocoles distincts dans des cellules RPE TP53−/− (Fig. 1a). Pour contrôler les changements de conformation de la chromatine associés à l'instabilité chromosomique (CIN) mais pas au WGD, nous avons induit la CIN dans des cellules RPE TP53−/− à l'aide d'un inhibiteur de MPS1 (Fig. 1a). Les analyses du cycle cellulaire et du caryotype ont confirmé que le nombre de chromosomes a doublé après le traitement dans la plupart des cellules (Fig. 1b, c et Données étendues, Fig. 1b – g) et que la taille nucléaire a augmenté (Données étendues, Fig. 1h).

1, adjusted P < 0.01) were enriched in the interferon signalling pathway (Extended Data Fig. 4b), which is consistent with responses to abnormal mitotic segregation and stress31. Conversely, significantly downregulated genes (n = 619, log2(FC) < −1, adjusted P < 0.01) were enriched in the DNA replication, DNA repair and cell cycle pathways (Extended Data Fig. 4c), which is consistent with downregulation of DNA replication proteins in WGD cells7. Changes in expression were not associated with changes in compartment segregation and only moderately with boundary loss of insulation (Extended Data Fig. 4d,e), which indicated that these changes mostly reflected an acute cell response to WGD. In summary, WGD cells, but not CIN-only cells, exhibit LCS manifested in an increased proportion of contacts between long and short chromosomes, distinct chromatin subcompartments, and TADs./p> 0.4), which is a known oncogenic variant37. Nevertheless, this mutation was already present in RPE TP53−/− cells before WGD, and it was not sufficient to induce tumorigenesis in mice (Fig. 4c). Conversely, mutations that were acquired post-WGD did not include known oncogenic variants (Supplementary Table 3)./p> 0.3). These changes comprised upregulation of inducers of cell proliferation and migration such as CDC42, NRAS and JUN (chromosome 1p)42,43, and downregulation of CENPF (chromosome 1q), which is associated with mitotic errors44. NRAS copy number gain was accompanied by an increase in Q61R variant allele frequency (VAFtumour1 = 0.9, VAFtumour2 = 0.75, VAFtumour3 = 0.74), which suggested that the mutated allele was in the amplified haplotype. JUN overexpression was concomitant with an upregulation of components of the AP-1 transcription factor complex (JUND, JUNB, FOS and FOSB) and its downstream targets (Extended Data Fig. 8h). In summary, tumours originated from RPE TP53−/− cells that underwent WGD exhibited hallmarks of WGD-driven human tumours, such as increased CIN and complex rearrangements potentially associated with oncogene activation./p>

4N peak) were bulk sorted. Cells were allowed to recover overnight and then fixed for downstream analyses./p>

90%). Only Hi-C interactions for which anchors mapped strictly to one of the two haplotypes were retained for analysis, thus obtaining three sets of interaction types: Hap1–Hap1, Hap1–Hap2 and Hap2–Hap2./p>

2 for diploid loci) would indicate a nuclei aggregate rather than a single nucleus. Following dispensing, the single nuclei were de-crosslinked by incubation at 65 °C overnight. Next each selected nucleus was mixed with 25 µl Dynabeads MyOne Streptavidin C1 and transferred to a 1.5 ml tube and incubated at room temperature for 1 h on a rotating wheel. The bead-bound fragments were digested with 10 U of AluI restriction enzyme (New England Biolabs, R0137) in 1× rCutSmart buffer (New England Biolabs, B6004) at 37 °C for 2 h. A-tailing reaction and adapter ligation were performed for each single cell as for the bulk Hi-C processing. Similarly, PCR amplification of the single cell libraries was performed in the same master mix as described above for bulk Hi-C, for 27–30 cycles. Libraries were cleaned using AMPure XP beads and then ran on a 2% agarose gel at 100 V for 50–60 min. Successful libraries presented a 300–700 bp smear, which was cut from the gel. DNA purification from the agarose was performed using NucleoSpin Gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel, 740609) following the manufacturer’s instructions. An additional AMPure XP bead size selection was generally necessary to remove any primer dimer contamination. Libraries were sequenced on a NextSeq550 platform (Illumina) in a PE75 configuration./p>

= 6, it was kept./p>

4N) (b) and c, Quantification of chromosomes per cell via karyotyping. Data are mean ± s.d.; Number of independent experiments is indicated. Violin plots: dashed line is median d, Examples of chromosomal instability markers (telomere fusion and chromosome breakages) in CP-ATP53−/− clone 19 cells 24 h post-WGD. n = 3 out of 30 total karyotypes presented such markers. Red arrows indicate affected chromosomes. e, Examples of bipolar and multipolar division in RPETP53−/− cells (Control and 24 h post-WGD). n = 5 dividing cells were detected for each phenotype out of ~100 total cells. Nuclei are stained in blue (DAPI), cytoskeleton (alpha-tubulin) in red, and centrosomes (pericentrin) in green./p>